RESUMO Neste estudo, os efeitos tóxicos da melitina em células Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) foram analisados quanto à funcionalidade mitocondrial, por redução de MTT e citometria de fluxo, potencial de apoptose, necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica e fragmentação de DNA, utilizando-se citometria de fluxo e desestabilização da membrana celular, por microscopia confocal. A toxicidade apresentou características dose-dependentes e a atividade mitocondrial foi inibida até 78,24±3,59% (P<0,01, n = 6) em células MDBK expostas à melitina (10μg/mL). Análises por citometria de fluxo revelaram que a melitina a 2μg/mL apresentou o maior índice necrótico celular (P<0,05). A maior lipoperoxidação de membranas também foi na concentração de 2μg/mL de melitina (P<0,05), o que foi posteriormente confirmado por microscopia confocal. A maior produção de ROS aconteceu quando as células foram expostas a 2,5μg/mL de melitina (P<0,05), e essa concentração também aumentou a fragmentação de DNA (P<0,05). Houve uma significativa correlação positiva entre a lipoperoxidação de membranas e a produção de ROS (R=0,4158), funcionalidade mitocondrial (R=0,4149) e apoptose (R=0,4978). Portanto, o estresse oxidativo gerado pela melitina culminou na elevação de ROS intracelular, que inicia uma cascata de eventos tóxicos nas células MDBK.

ABSTRACT In this study, the toxic effects of melittin on Madin-Darby Bovine Kidney cells (MDBK) were analyzed with respect to mitochondrial functionality by reduction of MTT and flow cytometry, apoptosis potential, necrosis, oxygen reactive species (ROS) production, lipid peroxidation, and DNA fragmentation using flow cytometry and cell membrane destabilization by confocal microscopy. The toxicity presented dose-dependent characteristics and mitochondrial activity was inhibited by up to 78.24 ±3.59% (P<0.01, n = 6) in MDBK cells exposed to melittin (10μg/mL). Flow cytometry analysis revealed that melittin at 2μg/mL had the highest necrosis rate (P<0.05) for the cells. The lipoperoxidation of the membranes was also higher at 2μg/mL of melittin (P<0.05), which was further confirmed by the microphotographs obtained by confocal microscopy. The highest ROS production occurred when the cells were exposed to 2.5μg/mL melittin (P<0.05), and this concentration also increased DNA fragmentation (P<0.05). There was a significative and positive correlation between the lipoperoxidation of membranes with ROS (R=0.4158), mitochondrial functionality (R=0.4149), and apoptosis (R=0.4978). Thus, the oxidative stress generated by melittin culminates in the elevation of intracellular ROS that initiates a cascade of toxic events in MDBK cells.

RESUMO Das células do sistema imunológico, macrófagos desempenham um papel fundamental. Apamina, constituinte do veneno de abelhas, é importante na defesa destas. Objetivou-se avaliar o metabolismo da linhagem de macrófagos J774 1.6 expostos à apamina isolada e purificada, avaliando-se citotoxicidade por redução de MTT e análise por citometria de fluxo (apoptose / necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), lipoperoxidação membranosa (LPO), potencial elétrico da membrana mitocondrial (MMP) e fragmentação do DNA). Nenhuma concentração testada (10 a 100μg / mL) foi citotóxica. As taxas de apoptose diminuíram nas concentrações 2,5, 5,0 e 10,0μg / mL (P<0,05), enquanto as de necrose aumentaram (P<0,05). Entretanto, as taxas de células saudáveis na maior concentração testada (10μg / mL) não diferiram do controle (P>0,05). A apamina não alterou as ERO, a LPO nem a fragmentação do DNA. Portanto, todas as concentrações analisadas (1,25 a 10μg / mL) diminuíram a mMP. Tal diminuição na apoptose pode ser por uma supressão de mensageiros pró-apoptóticos mitocondriais, já que este peptídeo não causa estresse oxidativo, peroxidação lipídica nem dano ao DNA. Técnicas altamente sensíveis são importantes para adequada interpretação dos mecanismos de citotoxicidade.

ABSTRACT Among the immune system cells, macrophages have an important role. Apamin, a bee venom constituent, is important in the defense of these insects. Thus, we aimed to evaluate the metabolism of J774 1.6 macrophage cell line when exposed to isolated and purified apamin, using cytotoxicity tests by MTT reduction and analysis by flow cytometry (apoptosis / necrosis, production of reactive oxygen species (ROS), membranous lipoperoxidation (LPO), electrical potential of the mitochondrial membrane (mMP) and DNA fragmentation). None of the tested concentrations (10 to 100μg/mL) were cytotoxic according to MTT reductions. Apoptosis rates decreased at concentrations of 2.5, 5.0, and 10.0μg/mL (P<0.05), while necrosis rates increased (P<0.05). However, rates of healthy cells at the highest tested concentration (10μg/mL) did not differ from control (P>0.05). Apamin did not alter ROS, LPO, or DNA fragmentation. Therefore, all analyzed concentrations (1.25 to 10μg/mL) decreased mMP. Such decrease in apoptosis might be due to a suppression of mitochondrial pro-apoptotic messengers, as this peptide causes no oxidative stress, lipid peroxidation, and DNA damage. Highly sensitive techniques are majorly important for proper interpretation of cellular toxicity mechanisms, combined with routine laboratory methods.

RESUMO A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.

RESUMO P34 é um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34, isolado do conteúdo intestinal de um peixe na Bacia Amazônica. Esse peptídeo demonstrou propriedades antibacterianas contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e foi caracterizado como uma substância do tipo bacteriocina. Foi demonstrado que o peptídeo P34 exibiu atividade antiviral contra o herpesvírus felino tipo 1 in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o P34 in vitro, em cultivo de células RK 13, contra o vírus da arterite equina, uma vez que não há tratamento específico e uma variável proporção de garanhões pode permanecer persistentemente infectada. Os resultados obtidos mostram que o peptídeo exerce atividade antiviral e virucida contra o vírus da arterite equina, agindo provavelmente no envelope viral. Os ensaios antivirais realizados demonstraram que o P34 reduz significativamente os títulos do vírus nas células infectadas e tratadas. O mecanismo de ação do P34 parece ser tempo/temperatura dependente. Esse peptídeo tende a ser um antiviral promissor para o tratamento e a prevenção das infecções por arterivírus, tendo em vista que ele possui um alto índice terapêutico. Contudo, estudos mais detalhados devem ser realizados para precisar a etapa exata da infecção viral em que o P34 age, para que ele possa ser usado como antiviral in vivo no futuro.

ABSTRACT P34 is an antimicrobial peptide produced by Bacillus sp. P34, isolated from the intestinal contents of a fish from the Amazon basin. This peptide showed antibacterial properties against Gram-positive and Gram-negative bacteria and was characterized as a bacteriocin like substance. It was demonstrated that the peptide P34 exhibited antiviral activity against feline herpesvirus type 1 in vitro. The aim of this work was to evaluate P34 for its antiviral properties in vitro, using RK 13 cells, against the equine arteritis virus, since it has no specific treatment and a variable proportion of stallions may become persistently infected. The results obtained show that P34 exerts antiviral and virucidal activities against equine arteritis virus, probably in the viral envelope. The antiviral assays performed showed that P34 reduces significantly the viral titers of treated cell cultures. The mechanism of action of P34 seems to be time/temperature-dependent. This peptide tends to be a promising antiviral compound for the prevention and treatment of arteriviral infections since it has a high therapeutic index. However, more detailed studies must be performed to address the exact step of viral infection where P34 acts, in order to use this peptide as an antiviral drug in vivo in the future.

No Brasil existem poucos estudos sobre a ocorrência da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV), assim como a determinação dos subtipos circulantes, o que é indispensável para o desenvolvimento de vacinas e novos testes diagnósticos. O presente trabalho investigou a ocorrência da infecção pelo FIV entre os anos de 2010 e 2011 em gatos domésticos submetidos a atendimento clínico na cidade de Pelotas e região. Amostras de sangue total de 70 animais, incluindo suspeitos (28) ou não suspeitos (42) da infecção pelo FIV, foram submetidas à reação de PCR nested. Os resultados indicaram uma frequência de infecção de 15,7% (11/70) e a análise dos fatores associados (sexo, idade e condição clínica) evidenciou uma maior ocorrência em gatos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções crônicas e recidivantes. Oito amostras positivas na PCR nested foram submetidas a sequenciamento genômico e somente o subtipo B foi detectado na região estudada.

In Brazil there are few studies on the occurrence of the feline immunodeficiency virus (FIV) infection and its subtypes, which are essential for the development of vaccines and new diagnostic tests. The present study investigated the occurrence of the FIV infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical attendance in the city of Pelotas and nearby area. Total blood samples of seventy cats, suspected (28) or not (42) of infection by FIV were analyzed by nested PCR in order to perform a diagnosis. The results pointed to a FIV infection frequency of 15.7% (11/70) and the analysis of the risk factors related to infection (sex, age and clinical condition) evidenced a greater occurrence in cats up to 10 years of age with chronic and recurrent infections. Eight samples found positive by nested PCR were submitted to DNA sequencing indicating that only the subtype B was detected in the studied region.

Canine parvovirus type 2 (CPV-2) is a leading cause of diarrhea in puppies in several parts of the world. In this study CPV-2 was detected and recovered from puppies showing clinical disease from Montevideo, Uruguay. Samples were processed and used to infect CRFK and MDCK cells in order to isolate the virus. Out of twelve, two samples were positive for CPV-2. A genomic region of 583 bp was amplified and the molecular characterization was performed by sequencing, phylogenetic analysis and Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Two isolated viruses (UY1 and UY2) were CPV-2c-like viruses. The comparison between the cytophatic effect (CPE) of CPV-2 (vaccinal virus) and CPV-2c (isolated virus) on primary canine cells cultures and on CRFK line cells, demonstrated that CPV-2c is less citopathogenic in CRFK than in primary cultures. Our study represents the first report on isolation and characterization of canine parvovirus type 2c (CPV-2c) in cell cultures from South American dogs.

Durante o processo de resfriamento dos ovos embrionados, há um fluxo natural de ar da superfície para o interior dos ovos carreando contaminantes como bactérias e fungos, por meio dos poros da casca, infectando o embrião e resultando na inabilidade para eclodir e pintinhos de má qualidade. O formaldeído que é um produto tóxico ainda é o desinfetante mais utilizado para a desinfecção de ovos embrionados pela indústria avícola. Para avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico da própolis verde, como alternativa ao formaldeído, foram coletados 140 ovos de ninhos de matrizes de frango de corte submetidos à desinfecção com cinco tratamentos: T1 - sem desinfecção; T2 - ovos fumigados com formaldeído; T3, T4 e T5 desinfetados por imersão com solução de própolis nas concentrações de 2.400 µg, 240 µg e 24 µg, respectivamente. Os níveis de contaminação da casca dos ovos por mesófilos totais e fungos (Aspergillus e outros bolores), após a desinfecção com própolis, foram menores quando comparados ao controle. Na comparação ao tratamento com formaldeído as concentrações de própolis com 240 µg e 24 µg não diferiram para atividade antibacteriana, já para atividade antifúngica, 2,4 mg e 240 µg foram superiores. Com relação à eclodibilidade dos ovos, após 21 dias de incubação, os tratamentos de própolis (2,4 mg e 240 µg) apresentaram as maiores taxas com 94,11% superando o tratamento com formaldeído. Portanto, o extrato etanólico de própolis verde apresenta atividade antibacteriana e antifúngica em ovos embrionados podendo ser um novo produto natural desinfetante em substituição ao formaldeído.

During the cooling process of embryonated eggs, there is a natural air flux from the surface to the inner part of the eggs, carrying contaminants such as bacteria and fungi through the shell's pores, infecting embryos and resulting in the inability to hatch or poor chick quality. Formaldehyde, a toxic product, is still the most used disinfectant for embryonated eggs in the aviculture industry. In order to evaluate the antimicrobial activity of the green propolis ethanolic extract as an alternative to formaldehyde, 140 hatching eggs from laying hens were collected and submitted to disinfection with five different treatments: T1 - without disinfection; T2 - formaldehyde fumigated eggs; T3, T4 and T5 disinfection by immersion in propolis solution in the concentrations of 2,400 µg, 240 µg and 24 µg, respectively. The contamination levels by total mesophiles and fungi of the egg shells (Aspergillus sp. and other moulds) after disinfection with propolis were lower than when compared to the control without disinfection. In comparison with formaldehyde, the 240 µg and 24 µg propolis concentrations did not differ regarding antibacterial activity, but for antifungal activity the 2,400 µg and 240 µg concentrations were more efficient. The 2,400 µg and 240 µg propolis treatments presented a hatching rate of 94.1%, compared to only 84.6% for the formaldehyde treatment. The green propolis ethanolic extract presented antibacterial and antifungal activities in embryonated eggs showing that it can be a new natural disinfectant product substituting formaldehyde.

RESUMO A própolis, uma substância resinosa produzida pelas abelhas melíferas a partir de exsudatos coletados em diferentes partes das plantas, tem sido utilizada há séculos na medicina popular devido as suas propriedades terapêuticas. Esta substância apresenta atividade antiinflamatória, antitumoral, antioxidante e imunomoduladora, embora muitos dos seus mecanismos de ação sejam desconhecidos. A imunomodulação pela própolis pode estar associada tanto com a estimulação quanto com a supressão de determinados eventos da resposta imune. Os efeitos antagônicos e muitas vezes não complementares sobre o sistema imunológico podem ser decorrentes da grande variabilidade química existente entre diferentes amostras de própolis, bem como das diferentes metodologias adotadas nos estudos científicos, resultando em variada ação farmacológica. Este artigo teve como objetivo revisar e discutir alguns aspectos relacionados à ação da própolis sobre o sistema imunológico.

ABSTRACT Propolis is a resinous substance produced by honeybees from exudates collected from different parts of the plants. It has been used for centuries in popular medicine due to its therapeutic characteristics. This substance presents antiinflammatory, anti-tumoral, anti-oxidant and immunomodulator activities, even though many of its mechanisms of action are still unknown. Immunomodulation induced by propolis can be associated with stimulation as well as suppression of certain events of the immune response. The antagonic and sometimes noncomplementary effects on the immunological system can be attributed to the wide chemical variability present among different propolis samples, as well as to the different methodologies used in scientific studies, resulting in a varied pharmacological action. This work aims at reviewing and discussing some aspects related to the mechanism of action of propolis on the immunological system.

Antibody titres to canine distemper virus (CDV) and canine parvovirus (CPV) were measured in 132 dogs: 80 had been vaccinated at least once, 22 had not been vaccinated, and 30 had unknown vaccination history. Serum antibody titers were measured by means of serum neutralization (CDV) or hemagglutination inhibition (CPV). Serum CDV titers >20 and serum CPV titers >80 were considered protective. Protective antibodies to CDV were present in 40.1% of the population: 39.8% of the vaccinated dogs, 31.8% unvaccinated, and in 46.6% of the dogs with unknown vaccination history. Protective antibodies to CPV were present in 90.9% of the dogs: 93.7% of the vaccinated dogs, 90.9% of the unvaccinated, and 83.3% of the dogs with unknown vaccination history.

Com o objetivo de otimizar a técnica de imunoistoquímica para detecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) em tecidos do sistema nervoso central fixado em formaldeído, foram avaliados diferentes métodos de digestão enzimática, diferentes anticorpos e reagentes para bloqueio de reações inespecíficas. As reações apresentaram a máxima intensidade de coloração específica e a quantidade mínima de coloração de fundo quando foram usadas protease de Streptomyces griseus (0,1%) ou proteinase K de Tritirachium album limber (0,05%), mediante incubação durante 15 minutos a 37°C. Entre os anticorpos monoclonais analisados, dois foram capazes de detectar BHV-5. As reações inespecíficas foram bloqueadas mais efetivamente pela incubação do tecido com caseína (0,5%), durante cinco minutos, ou leite em pó (2,5%), durante 60 minutos, ou soro eqüino (2,5%), durante 60 minutos. Com a técnica otimizada foi possível a detecção de BHV-5 em material de arquivo.

In order to optimize immunohistochemical technique (IHC) for detection of Bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) on formalin-fixed sections of central nervous system, different methods of enzymatic digestion, use of different antibodies and products for blocking of nonspecific reactivity were evaluated. The reactions showed the highest intensity of specific coloration and the minimum amounts of background when protease from Streptomyces griseus (0.1%) or proteinase K from Tritirachium album limber (0.05%) were used, incubating for 15 minutes at 37°C. Only two of the tested monoclonal antibodies specifically labelled BHV-5 antigen. The nonspecific reactions were blocked through incubation of tissues with casein (0.5%) for five minutes or powdered milk (2.5%) for 60 minutes or equine serum (2.5%) for 60 minutes. The optimized immunohistochemical method allowed the detection of BHV-5 antigen in histopathological archives.